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Cell Stem Cell | 杜鹏课题组利用全能性干细胞实现小鼠早期胚胎发育过程精准重建

日期: 2025-01-18

早期胚胎发育是生命科学领域的核心研究方向之一。胚胎从受精卵开始发育,经过基因组激活(zygotic genome activation, ZGA)、快速细胞分裂和谱系分化,最终形成囊胚,为胚胎着床及后续发育奠定基础。在这一过程中,囊胚内三谱系的形成——内细胞团(inner cell mass, ICM)、原始内胚层(primitive endoderm, PrE)和滋养外胚层(trophectoderm, TE)——标志着胚胎命运决定的关键转折点。然而,受限于胚胎样本的稀缺性和实验条件的限制,如何构建精准模拟早期胚胎发育的体外系统,仍是该领域亟待解决的科学难题。

2021年,北京大学杜鹏教授课题组通过抑制剪接体,首次捕获并稳定培养了小鼠全能性干细胞(mouse totipotent blastomere-like cells, mTBLCs)(Shen et al., 2021)。与经典的多能性干细胞不同,mTBLCs能够重现全能性卵裂球的特征,为构建从单细胞开始的分化和囊胚形成模型提供了理想的“种子细胞”。 随后,在2024年,研究团队利用相同的策略成功获得了人的全能性干细胞(Li et al., 2024),为进一步探索全能性及其在胚胎发育研究中的应用提供了重要工具。

基于mTBLCs的这一特性,2025年1月17日,杜鹏课题组在Cell Stem Cell杂志在线发表了题为“Mouse totipotent blastomere-like cells model embryogenesis from zygotic genome activation to post implantation”的研究论文。在这项研究中,作者进一步优化了mTBLCs培养条件,并开发了mTBLCs自发分化和单细胞起始的类囊胚形成系统,mTBLCs-类囊胚具有EPI、PrE和TE谱系,并能进一步形成着床后阶段的卵圆柱胚样结构,重现了从ZGA至囊胚形成的完整发育过程。这一突破为研究全能性、细胞命运决定以及早期胚胎形态发生提供了新的技术平台,也为早期发育的基础与转化研究开辟了新的可能性。

论文截图

图1. 通过mTBLCs模拟小鼠早期胚胎发育的关键事件的模式图

在本研究工作中,作者主要有以下发现:

1:该研究通过优化培养基(2MYCP),显著提高了mTBLCs的增殖速度和长期自我更新能力,主要通过加入2-DG、Minocycline、Y-27632、CHIR-99021和PlaB等因子。在此过程中,PlaB发挥了关键作用,通过抑制剪接驱动了从多能性向全能性的转变,而Oct4基因的去除并未影响mTBLCs在2MYCP培养基中的自我更新能力,表明Oct4不是维持细胞全能性的必要条件。2MYCP培养基中,Wnt信号通路在mTBLCs中被激活,且Wnt信号通路与细胞周期、增殖通路的激活与mTBLCs的快速自我更新能力密切相关。进一步的实验结果表明,抑制Wnt信号通路可显著抑制mTBLCs的增殖,证明Wnt信号对于2MYCP培养基中mTBLCs的快速扩增至关重要,但它并不参与维持mTBLCs的全能性。

图2. Wnt信号的激活促进了mTBLCs的快速扩增

2. mTBLCs具有独特的表观基因组特征,这些特征有助于其全能性维持和快速自我更新。通过ATAC-seq和CUT&Tag分析,发现mTBLCs的启动子区域(TSS)H3K27me3和H3K9me3整体水平下降,而H3K4me3、H3K27ac和RNA Pol II标记整体水平未发生显著变化,其表观特征与早期胚胎的初期胚胎细胞(如2细胞阶段)相似。此外,mTBLCs具有比PSCs更多的宽的H3K4me3域 (broad domain),以及更少的二价修饰基因(bivalent gene),且MERVL转座子在mTBLCs中具有显著的H3K4me3标记。Wnt信号通路的激活进一步增强了与细胞周期和增殖相关基因的H3K4me3富集,从而促进了mTBLCs的快速增殖。

图3. mTBLCs具有类似早期卵裂球的特定表观特征

3.本研究进一步评估了mTBLCs在体内外的分化潜力。在嵌合体实验中,通过单细胞数据,捕获到了EGFP标记的mTBLCs生成的13种细胞,其中包括7个胚外谱系和6个胚内谱系,证明了其在嵌合小鼠中的双向发育潜能。此外,mTBLCs通过类胚体(EBs)和畸胎瘤实验也都展示出了胚内外双向分化潜能,产生了包括神经、心脏和肾脏等三胚层来源的细胞,也激活了包括经典滋养层标志基因,展示其能够生成胚外滋养层样谱系。总体而言,mTBLCs具有强大的双向发育潜力,能够分化为各种胚内外谱系,成为评估全能干细胞发育潜力的重要工具。

图4. mTBLCs具有强大的胚内外双向分化潜能

4.本研究利用mTBLCs建立了一个模拟胚胎着床前发育的体外分化模型,以克服现有体外分化系统的挑战。在基础分化培养基中培养mTBLCs约3-4天后,细胞形态发生显著变化,形成了胚胎干细胞(ESC)、胚外内胚层干细胞(XEN)和滋养层干细胞(TSC)样的克隆。RNA-seq分析显示,mTBLCs在分化过程中激活了不同发育阶段的基因,经历了从早期初级基因组激活(minor ZGA)到主要基因激活(major ZGA)的转变。免疫组化验证了mTBLCs能够分化为上胚层(EPI)、胚外滋养层(TE)和原始内胚层(PrE)等谱系。单细胞RNA测序揭示,mTBLCs在分化过程中产生了涵盖2细胞、4细胞、8细胞及囊胚阶段的多种细胞类型,拟时间分析显示mTBLCs经历了两次命运决定,首次产生TE样细胞和ICM/EPI样细胞,随后ICM/EPI样细胞分化产生了PrE样细胞。

研究进一步发现,在自发分化过程中,mTBLCs 还产生了Zscan4+ 和 Zscan4- 两类基因组激活样细胞(ZLCs)。拟时间分析表明,只有Zscan4- ZLCs 能够成功分化为 EPI、PrE 和 TE 三大谱系。因此,本研究提出,主要的 ZGA调控网络可能至少可以分为由 Zscan4 表达标记的两个独立部分。同时,Zscan4 的表达可能并不是进一步干细胞命运决定所必需的。这一观察结果也与人类 TBLC 的自发分化过程一致,在这一过程中,经典的 ZGA 标志基因(如 ZSCAN4/5A、DUXA/B 和 TPRX1 等)完全没有被诱导表达(Li et al., 2024)。这些发现不仅进一步证实了 mTBLCs 的内在全能性,也为探索哺乳动物胚胎发育过程中的共性机制提供了新视角。